慢性髓系白血病起病隐匿，恶性程度高，预后不良。目前，慢性髓系白血病临床治疗主要包括放化疗、干细胞移植及免疫治疗等，其中以放化疗为主。由于化疗药物在杀伤白血病细胞的同时也杀伤人体正常细胞，且白血病细胞对化疗药物易产生耐药性是白血病治疗所面临的重大难题。因此，探索慢性髓系白血病的发病机制，寻找新型安全有效的白血病治疗药物具有重要的临床意义。
铁死亡是一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，其发生机制与细胞内脂质过氧化物及致死性活性氧（ROS）的生成与降解平衡失调密切相关[4-5]。白血病细胞对铁的需求显著高于正常细胞，对铁死亡具有更高的易感性[6]。研究表明，诱导急性髓系白血病细胞发生铁死亡可有效抑制白血病的恶性进展[7]。肿瘤蛋白53（p53）/亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶1（SAT1）/花生四烯酸15-脂氧合酶（ALOX15）是调节铁死亡的关键通路，p53激活后与SAT1基因启动子结合，促进其转录表达，SAT1通过乙酰化多胺代谢产物激活脂质过氧化关键酶ALOX15，调控铁死亡发生[8]。
人参皂苷Rg1是人参的重要活性成分之一，对造血系统和免疫系统功能有明确促进作用，在抗氧化、抗肿瘤、抗辐射损伤等方面也显示良好的功效[9-10]。本课题组前期研究发现，人参皂苷Rg1对人慢性髓系白血病细胞（K562）具有较好的增殖抑制作用，人参皂苷Rg1通过激活ATR/Chk1信号通路抑制K562细胞增殖[11]。本研究结合网络药理学，以K562细胞为实验对象，分析人参皂苷Rg1通过调控铁死亡抑制K562细胞增殖的可能作用机制，旨在为临床白血病药物研究提供实验依据。
YXQ-50S1立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅医疗生物仪器公司），BSC-1301ⅡA2生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司），MCO-18AIC CO2培养箱（Sanyo公司），AE-H8547细胞计数板（上海善然生物科技有限公司），AE31倒置显微镜（Motic公司），CytoFLEX流式细胞仪（Beckman公司），JEM1400透射电镜（日本电子公司），iMARK多功能酶标仪、垂直板电泳转移装置、Trans-Blot转膜装置电泳仪（Bio-Rad公司）。Tanon-4200凝胶成像系（上海天能科技有限公司）。
使用比较毒理基因组学数据库（CTD，）、基因信息数据库（GeneCards，）、本草图鉴（HERB，）检索人参皂苷Rg1的潜在作用靶点。利用GeneCards数据库以“chronic myeloid leukemia”作为疾病关键词进行检测，由于数据过于庞大，取3次“相关分数”的中位数进行筛选，生成慢性髓系白血病靶点数据集。从FerrDb V2数据库（）下载铁死亡驱动与抑制基因。将三者的靶点导入在线Venn工具（Venn/），获取交集靶点。
取交集靶点导入STRING数据库（），设定物种参数“homo sapiens”，互作置信度0.400进行PPI分析，运用Cytoscape绘制可视化网络。
2.3基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析
采用DAVID数据库（）对交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，生物种类设定为“homo sapiens”，标识符选择为“official gene symbol”，设置P＜0.05，并将P值按从小到大的顺序排列，富集结果通过微生信在线作图平台（）生成可视化图表。
用含10% FBS和1%青链霉素的RPMI1640培养基，将K562细胞置于37℃、5% CO2培养箱培养。每2～3天培养传代及冻存，取对数生长期细胞。
将K562细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，对照组为常规培养的K562细胞，加入与人参皂苷Rg1等量的PBS，人参皂苷Rg1组分别加入5、10、20、40、80 μmol/L人参皂苷Rg1，每组设5个复孔，另设不含细胞的空白组，南宫28娱乐平台共同置于培养箱中过夜，培养24、48、72 h后加入CCK-8试剂，于培养箱孵育2 h，酶标仪450 nm波长处检测吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。
取对数生长期细胞，以500个/孔的密度接种于24孔板内，置于培养箱中孵育7 d。细胞分为对照组（PBS）和人参皂苷Rg120 μmol/L组培养48 h，在倒置显微镜下观察各组细胞数量，细胞数＞50个为1个集落，计算细胞集落形成率。
细胞分组及处理同3.3项下，沉淀固定后用预冷的PBS洗涤，弃上清，碘化丙啶染色液重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30 min，随后4℃或冰浴避光保存，运用流式细胞仪检测激发波长488 nm处的红色荧光及光散射情况。
取对数生长期K562细胞以500个/孔的密度接种于6孔板，分组及细胞处理同3.3项下。无血清培养基洗涤细胞3次，加入300 μL 1 μmol/L FerroOrange工作液，培养箱中孵育15～30 min，进行荧光亚铁离子流式检测，使用532 nm绿色激光激发FerroOrange。
分组及细胞处理同3.3项下，添加BDP 581/591 C11工作液，培养箱内培养30 min，去除工作液，PBS清洗2次后，加入200 μL PBS溶液。
分组及细胞处理同3.3项下，K562细胞离心弃上清，PBS洗涤后加入2.5%戊二醛室温避光固定30 min，再用1%锇酸固定2 h。梯度乙醇脱水，环氧丙烷与环氧树脂1∶1浸透，纯环氧树脂包埋、切片，电子染色（铅染色）。电镜观察线粒体形态并拍摄保存。
分组及细胞处理同3.3项下，裂解液裂解细胞，提取并测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳、转膜后封闭，一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，TBST洗涤3次（每次5 min），二抗（1∶1 000）室温孵育1 h，重复TBST清洗3次（每次5 min），加入ECL曝光液反应，应用凝胶成像系统进行显影处理，Image J软件分析蛋白条带灰度值。
分组及细胞处理同3.3项下，K562细胞提取RNA，采用超微量分光光度计测定RNA的质量和浓度，将RNA逆转录成cDNA，进行qPCR反应，反应条件设置为95℃预变性2 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，40个循环收集荧光信号，利用2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量，引物序列见表1。
运用SPSS 20.0和GraphPad Prism 9.0完成数据分析和绘图，多组间采用单因素方差分析，组间比较通过独立样本t检验，南宫28娱乐平台结果以`x±s呈现。
通过多数据库联合分析，共获得人参皂苷Rg1靶点155个，慢性髓系白血病靶点1 757个，铁死亡靶点395个。Venn分析筛选出人参皂苷Rg1与慢性髓系白血病、铁死亡共同作用靶点26个，见图1，包括核因子E2相关因子2（NFE2L2）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、糖原合成酶激酶3β（GSK3B）、血红素氧合酶1（HMOX1）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、微RNA-214（MIR214）、cAMP反应元件结合蛋白1（CREB1）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、肿瘤蛋白p53（TP53）、丝氨酸/苏氨酸激酶11（STK11）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（CDKN1A）、沉默信息调节因子1（SIRT1）、ATP结合盒转运蛋白C1（ABCC1）、白细胞介素-1β（IL-1B）、磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ATM）、白细胞介素-6（IL-6）、醌氧化还原酶1（NQO1）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α（PIK3CA）、钙粘蛋白E（CDH1）、干扰素γ（IFNG）、热休克蛋白A5（HSPA5）、窖蛋白-1（CAV1）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A）。将交集靶点输入STRING数据库构建PPI网络，见图2。将网络信息导入Cytoscape进行可视化，见图3，网络图中TP53 degree值最高，靶点紧密中心性、介数中心性、degree值见表2。利用DAVID数据库进行GO功能和KEGG通路富集分析，结果经微生信平台可视化。GO分析显示，靶点主要富集于生物过程的基因表达的正向调控等、细胞组分的细胞质等以及分子功能的酶结合等，见图4。KEGG分析表明，靶点显著富集于癌症途径、p53信号通路等，见图5。基于上述多组学证据，推测人参皂苷Rg1可能通过调控p53信号通路介导铁死亡，发挥抗慢性髓系白血病的作用。
4.2.1人参皂苷Rg1对K562细胞增殖抑制能力的影响不同浓度人参皂苷Rg1处理K562细胞24、48、72 h后，与对照组相比，细胞增殖抑制率明显升高（P＜0.05），以20 μmol/L人参皂苷Rg1作用48 h时，抑制效果最显著，因此选择该作用浓度和时间进行后续实验，见表3。
4.2.2人参皂苷Rg1对K562细胞集落形成能力的影响与对照组相比，人参皂苷Rg1组K562细胞集落形成数减少（P＜0.01），提示人参皂苷Rg1能够降低K562细胞集落形成能力，见图6、表4。
4.2.3人参皂苷Rg1对K562细胞周期分布的影响与对照组比较，人参皂苷Rg1组细胞G0/G1期比例显著升高，S期比例降低（P＜0.001），G2/M期比例升高（P＜0.01），提示人参皂苷Rg1阻滞K562细胞于G0/G1期，细胞增殖能力下降，见图7。
4.2.4人参皂苷Rg1对K562细胞Fe2+的影响结果显示，与对照组比较，人参皂苷Rg1组相对Fe2+含量升高（P＜0.001），提示人参皂苷Rg1作用后，细胞内Fe2+含量积累，见图8。
4.2.5人参皂苷Rg1对K562细胞脂质ROS的影响与对照组比较，人参皂苷Rg1组K562细胞绿红荧光比值升高，脂质ROS相对含量增加（P＜0.01），提示人参皂苷Rg1能够增加K562细胞脂质过氧化水平，见图9。
4.2.6人参皂苷Rg1对K562细胞线粒体形态的影响超微结构显示，与对照组比较，人参皂苷Rg1组K562细胞内线粒体体积缩小，膜密度增加，线粒体嵴密度降低、融合甚至消失，提示人参皂苷Rg1作用后，细胞内出现了铁死亡形态学变化，见图10。