代的成体干细胞。丌展ＳＳＣｓ的研究对于精子发生机理研究、遗传性疾病治疗、
转基因动物生产及多潜能干细胞制备具有十分重要的意义。然而，ＳＳＣｓ在小鼠
睾丸组织中含量甚微（约１／３，０００．４，０００个睾丸细胞），对ＳＳＣｓ的进一步研究应
用受限于ＳＳＣｓ的细胞数量及体外存活时间，因此，ＳＳＣｓ自增殖机制的阐明成为
目前亟需解决的问题。近来研究表明，Ｂｍｉｌ和ＪｐＭ，基因与干细胞自增殖密切相
关，然而上述基因对ＳＳＣｓ体外增殖是否有影响？国内外均未见报道。因此，本
研究从小鼠睾丸组织中克隆了Ｂｍｉｌ和Ｐｉｗｉ基因，制备了ｒＢＭｌｌ多克隆抗体，
利用免疫学检测、原位杂交及流式细胞分选技术等对Ｂｍｉｌ基因在睾丸组织中的
表达进行了深入的研究，构建了Ｐｉｗｉ基因真核表达载体、Ｂｍｉｌ真核表达载体和
ＲＮＡｉ载体，通过转染培养的ＳＳＣｓ，探讨了Ｂｍｉｌ和Ｐｉｗｉ基因对ＳＳＣｓ增殖的影
响。本研究首次发现并从不同角度证实了Ｂｍｉｌ基因表达于ＳＳＣｓ，作用于生精过
（Ｐ＜００１），抑制Ｂｍｉｌ基因的表达会导致ＳＳＣｓ的增殖受阻（Ｐ＜Ｏ．０１），即Ｂｍｉｌ
基因是ＳＳＣｓ自增殖的关键调控因子；发现Ｐｉｗｉ基因的过表达对ＳＳＣｓ的增殖有
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ—Ｈｉｓ－ＢｍｉＩ和ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ・ Ｈｉｓ－Ｐｉｗｉ载体终浓度分别为
２．４ｐｇ／ｍｌ、２．８Ｉｊｔｇ／ｍｌ时，促进ＳＳＣｓ增殖效果最佳。本研究为ＳＳＣｓ自增殖机制的
阐明及ＳＳＣｓ批量培养体系的构建奠定了基础，本论文对其它干细胞的研究也具
ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｔｏ ｄｅｓｃｅｎｔｓ．ＴｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆＳＳＣｓｉｓｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｓｔｕｄｙａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｒｅｌｉｍｉｔｅｄｆｏｒｔｈｅｃｅｌｌ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄＢｍｉｌＲＮＡｉｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆＢｍｉｌ
ｏｆＢｍｉｌａｎｄＰｉＷｉｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．ＩｔｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅｔｈａｔＢｍｉｌ
ｉｎ ＳＳＣｓ ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＳＳＣｓｑｕａｎｔｉｔｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈａｌｓｏ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｍｉｌ；Ｐｉｗｉ；ＳＳＣｓ；ｓｅｌｆ－ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
３ ３＇－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅｔｅｔｒａｈｙ＆ｏｃｈｌｏｆｉｄｅ
５－ｂｒｏｍｏ一４ｃｈｌｏｒｏ一３－ｉｎｄｏｌｙｌ—Ｂ—Ｄ—ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ
文是本人在导师指导下独立进ｔｆ｛＿的研究工作和取得的研究成果，除了文中特
生精过程是一个精确而又复杂的过程，依赖于ＳＳＣｓ的自我更新及增殖。ＳＳＣｓ
干细胞群。对于ＳＳＣｓ的研究，无论是对干细胞生物学特性的探索，还是对其在
基础研究、ｌ临床医学及社会生产等领域内的应用均具有十分重要的理论意义和实
１９９４年，Ｂｆｉｎｓｔｅｒ等异体移植小鼠生精细胞获得成功；１９９６年，他们跨物种
移植大鼠生精细胞再获成功；２００５年，他们将ＳＳＣｓ体外培养后对其进行转基因
动物生产技术的重大突破。利用ＳＳＣｓ制备转基因后代是一项新技术，本项技术
们对ＳＳＣｓ研究的不断深入，ＳＳＣｓ的分离富集、冻存、遗传操作及异体移植均取
得了很大的进展，如许多动物甚至入的ＳＳＣｓ在有饲养层和添加某些因子的条件
下，能体外存活或培养数周至数月，移植后可启动来自供体ＳＳＣｓ的精子发生；
ＳＳＣｓ经液氮冷冻可长期保存，复苏移植后仍然具有干细胞活性，同样可以产生
功能性精子；对ＳＳＣｓ进行体外遗传操作或基因修饰，经移植后可产生转基因动
物；体外培养的ＳＳＣｓ可诱导分化为不同类型的细胞，等等。上述进展充分展示
了ＳＳＣｓ在精子发生机制的研究、生育能力的恢复、雄性不育的治疗、遗传性疾
是种子细胞源不足。尽管许多学者在培养ＳＳＣｓ时通过添加各种不同因子等方法
不断对培养体系进行优化，但仍未实现批量扩增培养获得足量ＳＳＣｓ的目的。其
根本原因是由于ＳＳＣｓ自增殖机制尚不明了，无法在理论上对培养条件进行优化
指导。因此，探讨ＳＳＣｓ自增殖的分子机制，从自增殖分子机制入手，建立相应
最近报道，Ｐｉｗｉ基因家族及Ｂｍｉｌ基因对多种生物干细胞自增殖、配子发生、
ＲＮＡ沉寂及翻译调节具有关键作用。在生物体生长发育过程中，ＰｃＧ（Ｐｏｌｙｃｏｍｂ
Ｇｒｏｕｐ）蛋白是基因调控决定细胞命运的组成部份。ＰｃＧ蛋白通过形成巨大的多
目标复合物作用在染色体上的不同位点，致使染色体变构，从而调控基因的表达。
ＰｃＧ蛋白的主要作用目标是Ｈｏｍｅｏｔｉｃ基因簇（在脊椎动物中被称作Ｈｏｘ基因簇。
在果蝇中被称作Ｈｏｍｅｏｔｉｃ基因簇）。因此，ＰｃＧ基因，如Ｂｍｉｌ，Ｐｃ２，吼７，
ＥＺＨ２等与细胞增殖密切相关。第一个被鉴定的ＰｃＧ家族的功能基因是Ｂ细胞特
异单克隆鼠自血病毒整合位点基因（Ｂｍｉｌ），是果蝇Ｐｓｃ基因的同源基因。Ｂｒｏｉｌ
制剂ｐ１６、ｐ１９的表达水平；该基因对正常干，祖细胞增殖能力的调节起关键作用。
Ｂｍｉｌ基因缺失的白血病干细胞增殖潜能受损，最终停滞而表现为分化或凋亡，
而Ｂｍｉｌ基因则可完全纠『Ｆ这种增殖缺陷。造血干细胞、神经干细胞及间充质干
细胞的自增殖也需要Ｂｍｉｌ基因的参与。Ｂｍｉｌ基因的过表达可促进许多细胞的体
胞基因。在果蝇，尸Ｍｆ基因的正常表达为ＳＳＣｓ的自增殖所必须，该基因编码一
个同时出现子体细胞和生殖细胞的新的核质蛋白，消除ＳＳＣｓ中的ＰＩＷＩ蛋白会
ＳＳＣｓ数目及分裂活动的增加，提示ＰＩＷＩ蛋白是ＳＳＣｓ分裂的一个自主启动子和
关键性调节物。Ｐｉｗｉ基因突变体的主要的生殖细胞缺陷是生殖细胞发育起始后，
物、线虫及脊椎动物等多种进化距离不同的生物的Ｐ柳ｆ基因同系物的研究表明，
Ｐｉｗｉ基因家族很可能与干细胞维持自增殖活动的一个非常古老的保守机制有关。
但哺乳类ＳＳＣｓ的自增殖是否与其他干细胞一样也受Ｐｉｗｉ基因家族和Ｂｍｉｌ基因
存在的主要问题的基础上，就ＳＳＣｓ自增殖机制及ＳＳＣｓ批量培养体系的建立等
方面展开了研究。首先，从小鼠睾丸组织中克隆了Ｂｍｉｌ和Ｐｉｗｉ基因，制备了
ｒＢＭｌｌ多克隆抗体，并从不同角度对ＢＭｌｌ的表达定位进行了研究，发现在小鼠
睾丸中，ＢＭｌｌ表达于ＳＳＣｓ；在许多细胞系及小鼠体内诸多器官中，ＢＭＩＩ也有
守机制相关；其次，构建了Ｂｍｉｌ基因和Ｐｉｗｉ基因真核表达载体及ＲＮＡｉ载体，
分另Ｕ将这些载体导入到体外培养的ＳＳＣｓ和ＳＴＯ细胞滋养层中，发现抑制内源性
Ｂｍｉｌ基因的表达，会导致ＳＳＣｓ的增殖受阻；Ｂｍｉｌ基因和Ｐ伽ｆ基因的过表达对
ＳＳＣｓ的体外增殖有显著的促进作用（Ｐ＜０．０１）；而过表达Ｂｍｉｌ基因和Ｐｉｗｉ基因
的ＳＴＯ细胞滋养层对ＳＳＣｓ增殖则无显著作用。不同浓度载体转染的比较结果表
明，当ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ—Ｈｉｓ—Ｂｍｉｌ和ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ—Ｈｉｓ—Ｐｉｗｉ载体转染ＳＳＣｓ浓度
上述研究结果表明，Ｂｍｉｌ是ＳＳＣｓ自增殖重要调控因子：Ｐｉｗｉ基因的过表达
可促进ＳＳＣｓ的体外增殖。在ＳＳＣｓ体外扩增体系中，Ｂｍｉｌ和Ｐ伽ｆ基因可作为小
更新及分化…。自Ｂｒｉｎｓｔｅｒｉ２，３】手Ｒ道ＳＳＣｓ异体（种）移植以来，ＳＳＣｓ逐渐成为干细
胞研究的新热点。在小鼠睾丸中，ＳＳＣｓ位于紧贴曲细精管基膜的部位，圆形或
椭圆形，直径１２１ａｍ左右，细胞核呈圆形或椭圆形，体积较大，内含核仁２—３个，
多靠近核膜，胞质中的细胞器除核糖体外均不发达。ＳＳＣｓ起源于外胚层，此时
它是一个不连续的分散的细胞群体，呈碱性磷酸酶阳性并能表达Ｏｃｔ－４、ｃ．ｋｉｔ和
ＭｅｓＰ一１（４，”。随着胚胎发育，这些细胞迁移到胚外中胚层。此间，原始生殖系细
生殖腺嵴。在雄性生殖腺嵴，原始生殖系细胞被支持细胞－－Ｓｅｒｔｏｌｉ前体细胞包围，
共同形成被称为生精索（ｓｅｍｉｎｉｆｅｒｏｕｓｃｏｒｄ）的实体细胞团。此时，原始生殖系
细胞的形态发生变化，被称为生殖母细胞或性原细胞【“。随着发育的进行，精索
逐渐形成腔隙，最后形成曲细精管。原始生殖系细胞到达生殖嵴后增殖１０，０００倍
［７－９］。当这些细胞发生分裂的时候，南宫28它们的后代细胞或者相互离开成为两个新的
干细胞，或者由细胞问桥连接而成为Ａ。，细胞。后者进一步分裂就形成了由４、８、
１６细胞组成的Ａ。ｌ型细胞。在生精上皮周期的特定时刻，Ａ。Ｉ型精原细胞分化成第
一代定向分化细胞一Ａｌ型精原细胞，后者再进行连续６次分裂，经历Ａ２、Ａ３、Ａ４、
Ｉｎ精原细胞，再分化为Ｂ型精原细胞。南宫28Ｂ型精原细胞的细胞核中富含异染色质，
核仁位于中央，经数次分裂后，体积增大，分化为初级精母细胞、次级精母细胞、
ＳＳＣｓ在成年动物睾丸中含量甚微，在小鼠中约为３，０００—２５，０００州１卜１３】；在大
鼠中约为８３０，０００个∽１５１。因此，为实现ｓｓｃｓ的体内或体外富集，需要对ＳＳＣｓ特
异性表面分子标记和功能性标记进行广泛深入研究。ＳＳＣｓ移植是指将Ｊ下常动物
或转基因、突变动物的ＳＳＣｓ或含有ＳＳＣｓ的生精细胞移入适宜受体睾丸曲细精管，
供体ＳＳＣｓ在受体睾丸内存活、迁移、定居、增殖进而启动供体精子发生过程。
该技术自１９９４年首次报道以来【３ｌ，十几年来不断完善，己成为ＳＳＣｓ检测鉴定的最
可靠的手段。目Ｉｊ｛『，人们对ＳＳＣｓ的增殖分化机理仍知之甚少，主要是因为尚无
合适的方法来检测、鉴定这些细胞。ＳＳＣｓ移植技术的建立和发展为ＳＳＣｓ提供了
数量及面积，来确定核实一个样本中ＳＳＣｓ的有无和数量。因此，先假定ＳＳＣｓ表
最后确定这种分子标记是否适合作为ＳＳＣｓ的分子标讲１６。２６１。应用这一策略已确
成体干细胞“龛”的定位研究结果表明，“龛”与细胞外基质及其组分有密切联系
（２７】。最初对ＳＳＣｓ表面标记的筛选就是基于在体内ＳＳＣｓ与基膜类组分结合的推
测。层粘连蛋白是基膜中细胞外基质的主要成分，因为ＳＳＣｓ与基膜紧密相连，
Ｓｈｎｏｈａｒａ认为在体外ＳＳＣｓ会与层粘连蛋白相结合Ｉｌ“。将小鼠生精细胞在层粘连
蛋白包被过的培养板上短期培养，ＳＳＣｓ能得到５．７倍的的富集：将大鼠生精干
细胞在相同条件下培养，ＳＳＣｓ能得到８。５倍的富裂１４，坫】。而在胶原酶ｒｖ和纤维
连蛋白相类似的功能，该蛋白复合物可以与层粘连蛋白结合。以此复合物为标记，
Ｋｉｔ与精原细胞的增殖和分化相关，以Ｋｉｔ为表面标记对睾丸细胞进行筛选，却
以ｌｉｇｈｔ—ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ及其他ＳＳＣｓ细胞表面分子为标记，结合ＦＡＣＳ技术可以实现
ｓｃａａｅ０＋（ａ６．ｉｍｅｇｒｉｎ）＋（旺Ｖｏｉｍｅｇｒｉｎ）一为标记，
对隐睾小鼠睾丸细胞进行ＦＡＣＳ分选，可使ＳＳＣｓ富集比例达到１为Ｏ．４０口８’２９】。Ｔｈｙ．１
ｆＣＤ９０１是一个糖基磷脂酰肌醇锚定的糖蛋白，首先发现于胸腺Ｔ细胞．在ＨＳＣｓ、
问充质干细胞、胚胎干细胞和成体干细胞上都有表达，是ＳＳＣｓ的一个重要表面
分子标记盼３０捌１。在小鼠睾丸发育过程中，随着生精母细胞向基膜的迁移，Ｔｈｙ．１
表达量逐渐降低。研究结果表明，以ＭＨＣ．Ｉ为表面分子标记筛选出来的睾丸细
胞亚群，基本上没有干细胞活性，几乎所有的干细胞都存在于ＭＨＣ．Ｉ—Ｔｈｙ—ｌ＋Ｋｉｔ
一睾丸细胞亚群中㈣。另外，对ＳＳＣｓ的其它特征标记如ａ６和ｌｏｗｓｉｄｅｓｃａｔｔｅｒ而
言，ＭＨＣ．Ｉ—Ｔｈｙ—ｌ＋Ｋｉｔ一细胞群均呈现为阳性㈨２９１。对该细胞群的进一步研究表
明，该细胞群呈现为ＣＤ２４阳性，Ｓｃａ－１和ＣＤ３４阴性。而在造血干细胞中，ＣＤ２４、
小鼠造血干细胞群具有ＳＰ（ｓｉｄｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）特性，可通过其与ＤＮＡ染料
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２结合发出的荧光而将之分离口５１。ＳＳＣｓ会不会也有ｓＰ特性呢？有的
研究小组认为以ＳＰ特性为标志，从睾丸细胞中分离出来的细胞群具有ＳＳＣｓ特性
７１，然而，也有研究小组持相反结论【１７，２４１，Ｋｕｂｏｔａｔｌ７】报道认为利用该方法筛
选出来的细胞群移植后不能产生ＳＳＣｓ克隆：同时，Ｋｕｂｏｔａ认为ＳＳＣｓ细胞群表现
为Ｌｙ６ａ（Ｓｃａ一１）阴性，而Ｆａｌｃｉａｔｏｒｉ／３６】认为ｓＳＣｓ群表现为Ｌｙ６ａ阳性。对于这两个
鼠，而有的研究小组用未成熟小鼠作为细胞供体。Ｋｕｂｏｔａ［＂】通过实验ｉＥ明ＳＳＣｓ
跟ＨＳＣｓ拥有共同的细胞表面标记Ｔｈｙ．１和ＣＤ２４ａ；而对于造血干细胞的其他标记，
如ＳＰ和ＣＤ３４，ＳＳＣｓ表现为阴性。在其他组织，如骨髓细胞、大脑和肌肉中广泛
表达的ＣＤ９，也表达于精原细胞【１９１。另外，ＳＳＣｓ还可以通过罗丹明１２３染色加以
分离，ＳＳＣｓ细胞群表现为Ｒｈｏ””［２４】。总之，ＳＳＣｓ的表面分子标记可以归结为（ｓｉｄｅ
ｓｃａｔｔｅｒ）ｌｏｗ ０ ６一ｉｎｔｅｇｒｉｎ＋，Ｂｌ—ｉｎｔｅｇｆｉｎ＋，ＣＤ２４＋，Ｔｈｙ—ｌ十，０ｔＶ—ｉｎｔｅｇｒｉｎ－，Ｋｉｔ－，ＭＨＣ．ｒ，
自１９９４年Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等异体移植小鼠生殖细胞，成功产生精子以来‘２—１，ＳＳＣｓ
注。近年来，随着科学技术手段的不断进步、完善，人们对ＳＳＣｓ研究的不断深
入，ＳＳＣｓ的分离富集、遗传操作及异体移植均取得了很大的进展，为ＳＳＣｓ在临
许多发育和调控机制并不太了解。ＳＳＣｓ体外培养及ＳＳＣｓ异体移植技术为研究精
子发生过程提供了新的研究途径。移植技术的发展使得研究生殖细胞发育，ＳＳＣｓ
能导致永久的或长时期的不育，而低温储藏ＳＳＣｓ和自体ＳＳＣｓ移植使得保存这些
患者的生育能力成为可能。可以在治疗前将患者的ＳＳＣｓ分离，培养，然后在治
疗后，待睾丸微环境恢复后，再将培养的ＳＳＣｓ移植回患者睾丸内。睾丸组织移
人类不育的原因大约有５０％来自男性，其中又有７０～９０％源自精子发生出现
（ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ）和少精子症（ｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ）是引起男性不育的常见原因。近
年来，ＳＳＣｓ移植技术的飞速发展，展现了其治疗男性不育方面广阔的临床应用
ＳＳＣｓ是唯一能将遗传信息传递给后代的成体干细胞。通过对培养的ＳＳＣｓ进