1.一种预处理用于哺乳动物家畜精原干细胞的维持和富集的培养基的方法，包括

　　(a) 使培养基与选自来自家畜哺乳动物胚胎成纤维细胞和/或来自分离自哺乳动物家

　　其中所述精原干细胞源自选自野生型成年睾丸、小牛或小狗睾丸、新生儿睾丸和隐睾

　　2.一种从包含至少一个精原干细胞的睾丸来源的细胞群体富集精原干细胞的方法，所

　　b) 使所述睾丸来源的细胞群体与所述预处理的培养基在适合精原干细胞维持和富集

　　5.权利要求4的方法，其中用Matrigel包被所述塑料培养孔，从而精原干细胞会粘附并

　　6.权利要求1的方法，其中所述培养基补充了生长因子，包括GDNF、FGF2、SDF‑1和CSF‑

　　7.通过权利要求2的方法获得的富集精原干细胞的群体在制备用于产生至少一个哺乳

　　动物子代的方法中的试剂盒的用途，所述产生至少一个哺乳动物子代的方法包括：

　　a)将所述富集精原干细胞的群体给予雄性受体哺乳动物的睾丸，其中不必从所述群体

　　其中所述精原干细胞源自选自野生型成年睾丸、小牛或小狗睾丸、新生儿睾丸和隐睾

　　8.权利要求7的用途，其中将所述富集精原干细胞的群体给予至所述受体哺乳动物的

　　本发明用美国农业部授予的合同号117232‑001的政府支助进行。政府具有本发明

　　不同细胞谱系的能力。自我更新的过程包括干细胞的自我复制以允许增殖和扩增，其中所

　　述干细胞保持未分化的状态。祖细胞也是具有分化为一种或多种细胞谱系的能力的未分化

　　的细胞，但是具有有限的自我更新或不能自我更新。当在培养中维持时，未分化的细胞如干

　　细胞或祖细胞可以进行自发分化，从而丧失期望的未分化的细胞表型。因此，需要最小化自

　　要，因为这些细胞的主要科学和治疗实用性在于它们扩增为同质群体的能力，所述同质群

　　体可以根据需要进一步增殖或分化为成熟细胞，例如用于科学研究或者修复患者的细胞或

　　组织的损伤。一旦它们在细胞培养中已自发分化，细胞较少增殖，并且较不能够根据需要分

　　化为不同类型的细胞。因此未分化的干细胞的同质培养是研究科学家和工业高度追求但未

　　目前培养未分化的细胞(例如，各种类型的干细胞)的方法试图通过每天或比每天

　　更不频繁地将成纤维细胞生长因子2(FGF2)递送至细胞培养物来最小化这样的自发分化，

　　这称作“饲养”。已显示FGF2通过抑制干细胞的分化来促进干细胞的自我更新；但是这种抑

　　制是不完全的，并且干细胞培养物倾向于逐步分化，从而减少干细胞培养物的实用性。此

　　外，干细胞如胚胎或精原干细胞通常需要在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞上生长。这

　　是个期望去除的繁琐步骤，并且导致污染了饲养细胞的细胞干细胞群体，其不可以用于各

　　物医学研究和动物育种(特别是如果可以对各种物种建立这类方案)提供长期追求的技术。

　　到目前为止，仅在大鼠和小鼠中最为成功，而较大的哺乳动物如牛，则没有这样的进展。

　　再生精子发生的能力的发现对于建立这类培养系统非常重要。参见Brinster  et  al .，

　　397。分离并实验操作这些干细胞的能力为精子发育、辅助生殖、细胞疗法和遗传学的研究

　　分离、增殖和遗传修饰培养中的全功能大鼠和小鼠精原干细胞的方案。参见Ryu  et  al .，

　　为这些研究的物种，这是由于它们作为人健康和疾病研究的实验室动物模型的普及，并且

　　由于缺少利用来自培养的克隆扩增的干细胞遗传修饰大鼠生殖系的方案。参见Hamra  et

　　许多潜在应用，在这个研究中寻求成本效益和易于制备的培养基用于体外原代大鼠精原干

　　尽管有这些进展，甚至在大鼠物种中，方法是复杂的且大部分不成功。例如，用于

　　体外啮齿动物精原干细胞的长期增殖的培养基相对复杂、昂贵、制备费事，加上在与成纤维

　　种无饲养细胞的培养系统，其允许培养的精原干细胞保持未分化的状态并在培养中长期保

　　持存活。本发明的另一方面包括从睾丸组织分离未分化的精原细胞的方法，鉴定在体外支

　　持未分化的精原细胞存活的特异性无血清的培养基，用于包被未分化的精原细胞粘附的塑

　　料培养孔的基材，并且最终申请人已鉴定用于补充饲养细胞条件培养基的特异性生长因

　　子，其促进牛未分化的精原细胞的维持和生长。虽然所述方法和实例公开了牛细胞，但是本

　　以及分离自牛睾丸的牛体细胞系。这些具体细胞系在培养任何SSC之前用作饲养支持细胞

　　以处理培养基。预培养技术允许无饲养细胞的培养，使得能够产生推定的牛SSC的纯群体用

　　于移植或其他用途。申请人的培养细胞没有其他饲养细胞系的污染和它们的有害作用，包

　　在一实施方案中，本发明介绍了一种从包含至少一个SSC的睾丸组织分离未分化

　　的精原细胞(其中精原干细胞(SSC)为一组分)的方法。所述方法包括获得包括至少一个SSC

　　的牛睾丸组织，使所述组织与胶原酶接触，从其他细胞类型分离生精小管，此后使所述生精

　　小管与胰蛋白酶接触以获得富含精原细胞和支持细胞(Sertoli  cell)的细胞悬浮液。所述

　　方法还可以用于产生自诱导的多能干细胞的SSC或者甚至已操作为SSC的胚胎干细胞。

　　在另一实施方案中，本发明介绍了一种富集和维持包含至少一个SSC的未分化的

　　精原细胞的纯培养物的方法，其中所述方法包括提供特定的具有血清替代物的无血清培养

　　基，进一步提供用Matrigel预包被的培养细胞孔，以及将特定生长因子GDNF、FGF2、SDF‑1和

　　CSF‑1添加至预处理培养基，所有工作一起第一次提供精原细胞，优选牛精原细胞的无饲养

　　理以提供无饲养细胞的培养方法。所述细胞系包括源自35日龄雄性Holstein胎儿的细胞系

　　牛胚胎成纤维细胞1(或BEF1，以前称为BEF)，以及源自分离自4月龄Holstein公牛睾丸的体

　　细胞的第二细胞系牛体细胞1(或BSC1，以前称为BSC)。这些细胞系一起可以用来预孵育培

　　养基，并且会提供SSC存活和增殖所必需的分泌的可溶性因子，一旦已引入SSC，不添加饲养

　　细胞。根据本发明，将培养基首先用这些细胞预处理，并且足够时间之后，南宫28娱乐平台去除饲养预处理

　　在本发明的一方面，所述SSC为牛SSC。在另一方面，SSC源自以下生物，选自小鼠、

　　在另一实施方案中，本发明介绍了支持SSC维持的无饲养细胞的培养系统，所述系

　　统包含富集的SSC、无血清的确定培养基以及用饲养细胞预处理的培养基。在另一实施方案

　　中，本发明介绍了支持SSC增殖的无饲养细胞的培养系统，其包含至少一个SSC、具有血清替

　　代补充物(StemPro)的无血清的确定培养基，以及已用专有的成纤维细胞细胞系BEF1和专

　　在本发明的一方面，培养系统还包含生长因子GDNF、FGF2、SDF‑1和CSF‑1。在另一

　　在本发明的另一方面，培养系统还包含用可商购的基质如Matrigel(生长因子减

　　少的版本)预包被的生长塑料培养孔。没有这样的包被，细胞不粘附至塑料孔，并且不可以

　　在另一实施方案中，本发明介绍了一种包含纯的、富集的SSC群体的组合物，其中

　　在另一实施方案中，本发明介绍了一种包含富集的SSC群体的组合物，所述富集的

　　SSC群体表达未分化的精原细胞的特异性标记以及与培养的SSC细胞相似的形态学。在一方

　　方法包括将不含饲养细胞的SSC群体给予雄性受体哺乳动物的睾丸，允许富集的SSC在受体

　　哺乳动物中产生精子发生的集落，以及使受体哺乳动物和与受体哺乳动物相同物种的雌性

　　哺乳动物交配。在一方面，将富集的SSC群体给予至受体哺乳动物的生精小管的腔。在另一

　　在本发明的一实施方案中，受体哺乳动物选自啮齿动物、灵长类、狗、牛、猪和人。

　　一个SSC的试剂盒。所述试剂盒包括培养系统(包含无血清的确定培养基)、用于预处理培养

　　基的专有BSC1和BEF1细胞、(或者已用专有BSC1和BEF1细胞预处理的培养基)、施药器以及

　　说明材料，其中所述说明材料包含使用所述试剂盒在无饲养细胞的培养系统中维持至少一

　　方案中，本发明介绍了根据本发明的方法制备的子代动物，其中富集的SSC用来制备包含至

　　要求保护的本发明部分理解为利用某些天然存在或转基因产生(“遗传工程”)的

　　雄性不育的牛作为供体精原干细胞的受体，动物与所述供体精原干细胞还是免疫相容的。

　　因此，移植的精原干细胞自由发育为功能精子，并且在不存在来自受体雄性可育时也会产

　　生的精子的竞争的情况下使雌性受精。以这种方式，可以从相对低数量的移植精子干细胞

　　因此，根据本发明的一方面，提供一种方法用于进行供体单倍型的种系传递。本发

　　明的方法包括以下步骤：(A)提供源自哺乳动物睾丸、诱导的多能干细胞或胚胎干细胞的精

　　原干细胞系的细胞，所述细胞系包含预定的遗传背景，然后(B)将一个或多个细胞移植入雄

　　胞的精原干细胞系的细胞文库。本发明的文库包含许多基因敲除或“敲入”突变的干细胞。

　　Matrigel包被的培养孔上用BEF1条件培养基进行无饲养细胞的培养期间形成的生殖细胞

　　团。中图是用DAPI染色以标记单个细胞核的团。右图是未分化的精原细胞标记PLZF的免疫

　　理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括

　　单数。一般来说，本文所述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋

　　白和核酸化学和杂交所用的命名以及它们的技术是本领域公知和常用的。除非另有说明，

　　方法和技术一般根据本领域公知的常规方法并如本说明书中引用和讨论的各种普通和更

　　在本说明书中短语“精原干细胞”表示分离自睾丸、产生自诱导多能干细胞、来自

　　胚胎干细胞或获得这类细胞的任何其他方法的干细胞。例如，产生自皮肤细胞的哺乳动物

　　的细胞并这样产生能够存活的后代。可以将分离的精原干细胞培养延长的时间而不丧失它

　　冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文中用来指一个或一个以上(即，至少一个)的

　　如本文所用，术语“基因”和“重组基因”指包含编码多肽的开放阅读框的核酸分

　　子。这类天然的等位变异通常可以导致给定基因的核苷酸序列中1‑5％变异。通过将许多不

　　同个体中所关注的基因测序可以鉴定可选等位基因。这可以通过利用杂交探针鉴定各种个

　　体中的相同基因位点容易地进行。任何和所有这类核苷酸变异以及所得的氨基酸多态性或

　　此外，编码来自其他物种的蛋白(同系物)的核酸分子(其具有与本文所述蛋白的

　　核苷酸序列不同的核苷酸序列)在本发明的范围内。对应于天然等位变体的核酸分子和本

　　发明的cDNA的同系物可以基于它们与核酸分子的相同性，利用人cDNA或其部分作为杂交探

　　当术语在本文中使用时，生物学过程的“调节”指生物学过程的正常进程的改变。

　　例如，精原干细胞活性的调节可以是所述细胞活性的增加。或者，精原干细胞活性的调节可

　　当术语在本文中使用时，“富集”指某物的浓度、数量或活性由先前的状态增加的

　　过程。例如，如果群体以前仅包含50个精原干细胞，则认为100个精原干细胞的群体“富集”