通过免疫荧光鉴定，作者发现在胚胎期16.5时（E16.5）精原干细胞首次出现。作者用ID4标记精原干细胞（SSC，ID4是SSC的特异性Marker），随后作者对这些SSC进行增殖检验，发现从E16.5到P2，SSC的数量急剧增长，在总生殖细胞中的比例也随之增长。南宫28

　　接着作者从三只E16.5时期小鼠中共捕获到3845个SSC细胞并进行了单细胞测序，结果表明干细胞Marker基因Dppa3、Sox2和Nanog在细胞中表达不一，但Oct4表达一致，这些结果首次表明了精原干细胞中干性基因表达的不一致。

　　通过将数据进行降维并绘制tSNE图，作者将SSC细胞分为三个细胞簇。单细胞RNA-seq结果显示，细胞簇1中SSC干性相关基因表达显著升高（除ID4以外，Etv5、Lhx1等也显著表达）；相反地，在细胞簇3中干细胞分化基因Dnmt3a、Dnmt3b表达显著升高。

　　作者发现，在P3时SSC细胞数量达到顶峰。作者用ID4标记发出的绿色荧光（eFP）强度来标记SSC细胞的干性程度：bright表示纯SSC细胞，另外两种（mid和dim）表示已经发生分化的SSC细胞。从图中可见，P3后SSC细胞数量减少，另外两种已发生分化的SSC细胞数量增多，这表明SSC进行了分化。

　　通过免疫荧光标记，作者观察到这些SSC细胞定位在巣（Nest）中；同时发现，这些nest在P3前数量急剧增加，但在P3后数量降低。

　　接着作者收集了E16.5、P0、P3和P6时期的SSC并进行单细胞测序。首先，作者验证了ID4的表达从E16.5开始出现，P0和P3都表达，到P6时几乎不表达。

　　这四个时期总共捕获到10140个细胞，将数据进行降维后，结果如图所示：根据UMAP聚类，细胞聚为10个细胞簇。表中可看到从1-10簇细胞各自捕获的细胞数，其中1-4簇为E16.5时期的细胞，5-6簇为P0时期的细胞，7-10簇是P3/P6时期的细胞，可以看到，每一个细胞簇的细胞总数在几百到一千这个数量级，这也提示了我们，在单细胞测序时不一定非要保证每个时间点或者样本细胞数达到几千乃至上万，只要质量过关，细胞数不是硬性要求。

　　这两幅图是本篇文章的核心所在。从图中看到，在E16.5的四个细胞簇中，细胞簇1的SSC干性Marker基因表达最高；在P0的两个细胞簇中，细胞簇5的的SSC干性Marker基因表达高；在P3/P6的四个细胞簇中，细胞簇7和9的干性Marker基因表达高。根据这一结果，作者推断出从胚胎期到出生后，SSC的“路径”是从细胞簇1到5到7再到9，这表明了出生后小鼠的SSC命运其实被“预设”好了，就是从细胞簇1开始（即表达SSC干性基因的细胞）。

　　同理，非SSC细胞的来源和去处也可从本图中得知：根据分化基因表达的丰度，得出细胞簇2/3/4到细胞簇6再到细胞簇8或者10。

　　作者从细胞簇1/5/7的测序数据中，挑选出三个代表基因，进行免疫荧光染色，证实了测序数据可靠。

　　根据单细胞测序结果，作者做了拟时序分析，并将表达差异的基因分为了四个组（Group1-4），向读者全景展示了精原干细胞从胚胎期到出生后的基因表达网络。从图中可以看到，Group1中主要是TGFb和Wnt信号通络激活；Group2中是转录因子富集；Group3是代谢和一些细胞迁移因子的上调；Group4富集了细胞周期和DNA复制因子。

　　最后，为了验证本试验所研究的SSC细胞具有增殖性，作者进行了移植实验（具有增殖性的细胞在移植后才能被检测到，没有增值性的细胞会消失）。移植到生殖细胞敲除的小鼠中2个月后，作者发现，在整个生殖细胞群中，南宫28只有SSC组检测到了移植细胞的存在，这一体内结果证实了本文得的结论。

　　本文选取的时期数非常多，数据很充分，有利于准确揭示出生物学现象，具体表现在：实验设计上分为体内和体外两部分，体内用荧光追踪SSC轨迹，体外用单细胞转录组测序做拟时序分析。两个方向互相映证，一方面通过单细胞测序对SSC轨迹变化做了基因层面的分析，另一方面通过体外实验辅助单细胞测序的cluster鉴定，达到了1+12的效果；另外，本文对Cluster的定义很清晰、很科学，用Marker基因的表达水平和表达细胞数量的可视化展示。

　　同时，本文也有一些不足之处：本文所展示的数据，除最后体内验证以外，其余缺乏直接的证据，更多依赖于推测；未探究SSC直接分化成生殖细胞过程中的机制（单细胞分析）。

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