本发明提供了一种人脐带间充质干细胞衍生物的精华液及其制备方法，涉及护肤品制备技术领域。先将甘油和丁二醇预分散搅拌混合均匀，置于同一个容器内，再加入人脐带间充质干细胞衍生物上清液，直至原料完全溶解；再依次添加羟乙基脲、聚乙二醇和双‑PEG‑18甲基醚聚二甲基硅氧烷进行混合，待溶液均匀无颗粒后，分装于合适密闭容器中，4℃静置至少30分钟，进行消泡操作。与现有技术相比，本发明制备的精华液中人脐带间充质干细胞衍生物上清液占比高，含有多种人体细胞因子，可以直接渗入肌肤，作用于组织细胞，促进皮肤干细胞修复和

　　1.人脐带间充质干细胞衍生物的精华液的制备方法，其特征在于，先将甘油和丁二醇

　　预分散搅拌混合均匀，置于同一个容器内，再加入人脐带间充质干细胞衍生物上清液，使用

　　磁力搅拌器，转速设置在400r‑600r，搅拌15‑20分钟，直至原料完全溶解；再依次添加羟乙

　　基脲、聚乙二醇和双‑PEG‑18甲基醚聚二甲基硅氧烷进行混合，待溶液均匀无颗粒后，分装

　　2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞衍生物的精华液的制备方法，其特征在

　　于，人脐带间充质干细胞衍生物上清液的收集步骤：将人脐带间充质干细胞无血清培养基

　　进行培养；待细胞汇合度达到80％后进行传代培养，使用0.125％胰蛋白酶消化，收集P3‑

　　P10代的细胞培养上清液，3500rpm，离心30分钟，去除细胞碎片，收获上层溶液。

　　3.根据权利要求1或者2所述的人脐带间充质干细胞衍生物的精华液的制备方法，其特

　　A相：将黄原胶、甘油和丁二醇预分散搅拌混合均匀，置于同一个容器内，再加入人脐带

　　间充质干细胞衍生物上清液，使用磁力搅拌器，转速设置在400r‑600r，搅拌15‑20分钟，直

　　B相：将羟乙基脲、甜菜碱、PCA钠、乳酸钠、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸盐酸

　　盐、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、吡咯烷酮羧酸、戊二醇、辛甘醇、小核菌胶、甘油葡糖苷、甘油、

　　聚乙二醇‑8依次加入同一个容器内，使用分散均质机，转速设置在2800r‑3500r，均质15‑20

　　C相：将双‑PEG‑18甲基醚聚二甲基硅氧烷、EDTA‑2钠、对羟基苯乙酮依次加入同一个容

　　器中，使用分散均质机，转速设置在2800r‑3200r，均质15‑20分钟，直至原料完全溶解；

　　S2、将A相、B相和C相混合，使用分散均质机，转速设置在2800r‑3200r，均质30分钟；待

　　溶液均匀无颗粒后，分装于合适密闭容器中，4℃静置至少30分钟，进行消泡操作。

　　4.一种人脐带间充质干细胞衍生物的精华液，其特征在于，包括：人脐带间充质干细胞

　　衍生物上清液占比70％‑80％，甘油3％‑5％，丁二醇4％‑5％，羟乙基脲4％‑6％，聚乙二醇

　　3％‑4％，双‑PEG‑18甲基醚聚二甲基硅氧烷2％‑4％，重量百分比计。

　　5.根据权利要求4所述的人脐带间充质干细胞衍生物的精华液，其特征在于，还包括：

　　6.根据权利要求5所述的人脐带间充质干细胞衍生物的精华液，其特征在于，还包括：

　　甜菜碱、PCA钠、乳酸钠、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸盐酸盐、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、吡

　　咯烷酮羧酸复配成分，总占比0.01％‑0.02％；戊二醇、辛甘醇、小核菌胶复配成分，总占比

　　7.根据权利要求6所述的人脐带间充质干细胞衍生物的精华液，其特征在于，还包括：

　　8.根据权利要求7所述的人脐带间充质干细胞衍生物的精华液，其特征在于，采用权利

　　9.根据权利要求4所述的人脐带间充质干细胞衍生物的精华液，其特征在于，采用权利

　　10.根据权利要求4‑7任一所述的人脐带间充质干细胞衍生物的精华液，其特征在于，

　　[0001]本发明涉及护肤品制备技术领域，特别涉及一种人脐带间充质干细胞衍生物的精

　　[0002]随着生活水平的提高与科技的进步，人们对皮肤美容的需求逐渐增加，各种功效

　　的护肤品层出不穷。研究发现含有间充质干细胞衍生物的精华液，可以极大的提高皮肤水

　　[0003]间充质干细胞是来源于早期中胚层的成体干细胞，具有高度自我更新能力和多向

　　分化潜能，可向多种组织如脂肪、骨及软骨等诱导分化，而且免疫原性低，具有广阔的临床

　　应用前景。研究发现干细胞衍生物是由活细胞释放的纳米大小的囊泡，直径通常在30‑

　　200nm，携带各种蛋白质、RNA和脂质类物质，可以促进成纤维细胞增殖和胶原合成、角质化

　　细胞再生，促进给皮肤细胞生长供给营养的血管生成，从而激活皮肤的自我修护系统，对皮

　　[0004]现在市面上的精华液品类繁多，但添加外泌体的精华液市场还比较空白，急需将

　　[0005]本发明提供了一种人脐带间充质干细胞衍生物的精华液及其制备方法，克服上述

　　[0006]具体技术方案是人脐带间充质干细胞衍生物的精华液的制备方法，先将甘油和丁

　　二醇预分散搅拌混合均匀，置于同一个容器内，再加入人脐带间充质干细胞衍生物上清液，

　　使用磁力搅拌器，转速设置在400r‑600r，搅拌15‑20分钟，直至原料完全溶解；再依次添加

　　羟乙基脲、聚乙二醇和双‑PEG‑18甲基醚聚二甲基硅氧烷进行混合，待溶液均匀无颗粒后，

　　[0007]进一步，人脐带间充质干细胞衍生物上清液的收集步骤：将人脐带间充质干细胞

　　无血清培养基进行培养；待细胞汇合度达到80％后进行传代培养，使用0.125％胰蛋白酶消

　　化，收集P3‑P10代的细胞培养上清液，3500rpm，离心30分钟，去除细胞碎片，收获上层溶液。

　　[0010]A相：将黄原胶、甘油和丁二醇预分散搅拌混合均匀，置于同一个容器内，再加入人

　　脐带间充质干细胞衍生物上清液，使用磁力搅拌器，转速设置在400r‑600r，搅拌15‑20分

　　[0011]B相：将羟乙基脲、甜菜碱、PCA钠、乳酸钠、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸

　　盐酸盐、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、吡咯烷酮羧酸、戊二醇、辛甘醇、小核菌胶、甘油葡糖苷、甘

　　油、聚乙二醇‑8依次加入同一个容器内，使用分散均质机，转速设置在2800r‑3500r，均质

　　[0012]C相：将双‑PEG‑18甲基醚聚二甲基硅氧烷、EDTA‑2钠、对羟基苯乙酮依次加入同一

　　个容器中，使用分散均质机，转速设置在2800r‑3200r，均质15‑20分钟，直至原料完全溶解；

　　[0013]S2、将A相、B相和C相混合，使用分散均质机，转速设置在2800r‑3200r，均质30分

　　钟；待溶液均匀无颗粒后，分装于合适密闭容器中，4℃静置至少30分钟，进行消泡操作。

　　[0014]一种人脐带间充质干细胞衍生物的精华液，包括：人脐带间充质干细胞衍生物上

　　清液占比70％‑80％，甘油3％‑5％，丁二醇4％‑5％，羟乙基脲4％‑6％，南宫28聚乙二醇3％‑4％，

　　[0016]进一步，还包括：甜菜碱、PCA钠、乳酸钠、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸盐酸盐、

　　精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、吡咯烷酮羧酸复配成分，总占比0.01％‑0.02％；戊二醇、辛甘醇、

　　[0018]进一步，采用本申请中前述人脐带间充质干细胞衍生物的精华液的制备方法进行

　　[0019]进一步，采用本申请中前述人脐带间充质干细胞衍生物的精华液的制备方法进行

　　[0020]进一步，人脐带间充质干细胞衍生物上清液的收集步骤采用本申请中前述方法收

　　[0021]由于采用了以上技术方案，与现有技术相比，本发明有以下技术优点：本发明制备

　　的干细胞衍生物精华液中人脐带间充质干细胞衍生物上清液占比高，含有多种人体细胞因

　　子，可以直接渗入肌肤，作用于组织细胞，促进皮肤干细胞修复和再生，强化皮肤屏障，从根

　　源上改善皮肤老化，具有抗炎与再生效果，经重金属和微生物检验、人体斑贴试验、毒理实

　　[0022]构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实

　　[0026]图4为5株细胞培养的细胞上清液中细胞因子VEGF和FGF浓度柱状图，

　　[0028]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施方式和附图，对

　　本发明作进一步详细说明。在此，本发明的示意性实施方式及其说明用于解释本发明，但并

　　[0029]人脐带间充质干细胞衍生物的精华液的制备方法，先将甘油和丁二醇预分散搅拌

　　混合均匀，置于同一个容器内，再加入人脐带间充质干细胞衍生物上清液，使用磁力搅拌

　　器，转速设置在400r‑600r，搅拌15‑20分钟，直至原料完全溶解；再依次添加羟乙基脲、聚乙

　　二醇和双‑PEG‑18甲基醚聚二甲基硅氧烷进行混合，待溶液均匀无颗粒后，分装于合适密闭

　　[0030]在一个实施例中，人脐带间充质干细胞衍生物上清液的收集步骤：将人脐带间充

　　质干细胞无血清培养基进行培养；待细胞汇合度达到80％后进行传代培养，使用0.125％胰

　　蛋白酶消化，收集P3‑P10代的细胞培养上清液，3500rpm，离心30分钟，去除细胞碎片，收获

　　[0033]A相：将黄原胶、甘油和丁二醇预分散搅拌混合均匀，置于同一个容器内，再加入人

　　脐带间充质干细胞衍生物上清液，使用磁力搅拌器，转速设置在400r‑600r，搅拌15‑20分

　　[0034]B相：将羟乙基脲、甜菜碱、PCA钠、乳酸钠、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸

　　盐酸盐、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、吡咯烷酮羧酸、戊二醇、辛甘醇、小核菌胶、甘油葡糖苷、甘

　　油、聚乙二醇‑8依次加入同一个容器内，使用分散均质机，转速设置在2800r‑3500r，均质

　　[0035]C相：将双‑PEG‑18甲基醚聚二甲基硅氧烷、EDTA‑2钠、对羟基苯乙酮依次加入同一

　　个容器中，使用分散均质机，转速设置在2800r‑3200r，均质15‑20分钟，直至原料完全溶解；

　　[0036]S2、将A相、B相和C相混合，使用分散均质机，转速设置在2800r‑3200r，均质30分

　　钟；待溶液均匀无颗粒后，分装于合适密闭容器中，4℃静置至少30分钟，进行消泡操作。

　　[0037]一种人脐带间充质干细胞衍生物的精华液，原料包括：人脐带间充质干细胞衍生

　　物上清液占比70％‑80％，甘油3％‑5％，丁二醇4％‑5％，羟乙基脲4％‑6％，聚乙二醇3％‑

　　[0039]在一个实施例中，还包括：甜菜碱、PCA钠、乳酸钠、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸

　　盐酸盐、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、吡咯烷酮羧酸复配成分，总占比0.01％‑0.02％；戊二醇、

　　[0040]在一个实施例中，还包括：EDTA‑2钠0.05％，对羟基苯乙酮0.5％，1，2‑己二醇

　　[0041]在一个实施例中，采用本申请中前述人脐带间充质干细胞衍生物的精华液的制备

　　[0042]在一个实施例中，采用本申请中前述人脐带间充质干细胞衍生物的精华液的制备

　　[0043]在一个实施例中，人脐带间充质干细胞衍生物上清液的收集步骤采用本申请中前

　　[0046]将人脐带间充质干细胞无血清培养基进行培养；待细胞汇合度达到80％后进行传

　　代培养，使用0.125％胰蛋白酶消化，收集P3‑P10代的细胞培养上清，放于4℃暂时保存。图1

　　[0048]收集P3‑P10代的细胞培养上清，3500rpm，离心30分钟，去除细胞碎片，收获上层溶

　　[0049]功效评价：炎症是临床中最常见的病症之一，是人体为了确保去除有害刺激并修

　　复受损组织的一种防御反应。当人体免疫细胞在受到致炎因子作用时，一些小分子量的、能

　　在细胞间传递信息的、并且具有特异性免疫调节功能的可溶性蛋白质或多肽通过机体本身

　　分泌出来，并参与或引起炎症反应，这些物质被称为炎症因子，包括NO、TNF‑α、IL‑6、PGE‑2、

　　IL‑1等。NO、TNF‑α、IL‑6都是炎症反应中重要的细胞活性因子，它们对细胞炎症都有直接或

　　间接的作用，彼此之间也产生影响。本实验通过使用LPS诱导的RAW264.7细胞作为体外炎症

　　细胞模型，通过ELISA试剂盒检测上清液中分泌的炎症因子(NO、TNF‑α、IL‑6、PGE‑2、COX)，

　　从而评估细胞上清液的抗炎作用。具体操作如下：称取干细胞衍生物上清液稀释得到浓度

　　为50％、25％、12.5％三个浓度，常规培养细胞，将细胞悬液接种于12孔细胞培养板，返回培

　　养箱培养18‑24h，取出培养板，弃去孔中原培养液，样品组每孔加入含不同浓度的测试样品

　　和LPS的培养液，模型组加入以LPS作为刺激物的培养液，阳性对照加入地塞米松和LPS的培

　　养液，对照组加入培养液，培养24±1h，收集上清液，‑80℃保存，细胞因子采用ELISA试剂盒

　　进行测定。以对照组细胞活性为100％，计算各组相对细胞活性和TNF‑α相对含量，结果见图

　　2，发现干细胞衍生物上清液在50.0％，25.0％，12.5％浓度均具有抗炎作用。

　　[0050]表皮生长因子(EGF)在体内能促进机体表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞的生长、

　　分裂，促进微血管的生长，改善细胞生长的微环境，促进创伤愈合；EGF主要生理活性是诱导

　　细胞增殖、分裂分化，促进其生长，尤其是表皮基底层细胞；EGF通过与细胞膜上受体的结

　　合，激活受体，产生一系列信号，从而加速皮肤新生细胞替代衰老细胞的进程。成纤维细胞

　　生长因子(FGF)具有广泛的促进生长等方面的生物活性，它可以促进血管内皮细胞、表皮细

　　胞、软骨细胞、神经纤维等细胞的生长，在临床上具有巨大的潜在的应用价值。血管内皮生

　　长因子(VEGF)是一种特异作用于血管内皮细胞的强有力的多功能细胞因子，它强烈而特异

　　[0051]本实验对5株细胞培养收获的细胞上清液中的细胞因子EGF、VEGF、FGF采用采用

　　ELISA试剂盒进行测定。结果见图3和图4，发现干细胞衍生物上清液中含有多种不同浓度的

　　[0055]A相：人脐带间充质干细胞衍生物上清液、黄原胶、甘油、丁二醇；

　　[0056]B相：羟乙基脲、甜菜碱、PCA钠、乳酸钠、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸盐

　　酸盐、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、吡咯烷酮羧酸、戊二醇、辛甘醇、小核菌胶、甘油葡糖苷、甘

　　[0057]C相：双‑PEG‑18甲基醚聚二甲基硅氧烷、EDTA‑2钠、对羟基苯乙酮

　　[0059]1)将A相原料中黄原胶、甘油和丁二醇预分散搅拌混合均匀，置于同一个容器内，

　　再加入细胞上清液，使用磁力搅拌器，转速设置在450r，搅拌15‑20分钟，直至原料完全溶

　　[0060]2)将B相中各原料依次加入同一个容器内，使用分散均质机，转速设置在3000r，均

　　[0061]3)将C相中各原料依次加入同一个容器中，使用分散均质机，转速设置在3000r，均

　　[0062]4)将A、B、C三个相混合，使用分散均质机，转速设置在3000r，均质30分钟；待溶液

　　均匀无颗粒后，分装于合适密闭容器中4℃静置至少30分钟，进行消泡操作，将制备完成的

　　[0063]最终人脐带间充质干细胞衍生物上清液占比77.84％，黄原胶0.1％，甘油3％；丁

　　二醇4％，羟乙基脲5％，甜菜碱、PCA钠、乳酸钠、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸盐酸盐、精

　　氨酸、苏氨酸、脯氨酸、吡咯烷酮羧酸复配成分总占比0.01％，戊二醇、辛甘醇、小核菌胶复

　　配成分总占比1％，甘油葡糖苷1.5％，聚乙二醇‑83.5％、双‑PEG‑18甲基醚聚二甲基硅氧烷

　　[0065]用灭菌吸管吸取1：10稀释的样本1mL，注入到一个灭菌平皿内，再将融化并冷却至

　　45℃‑50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使

　　样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃培养箱内培养48h±

　　2h。另取1个不加样品的灭菌空平皿，为空白对照；点数菌落总数。结果：菌落总数＜10CFU/

　　mL，霉菌和酵母菌＜10CFU/mL，耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌未检出，符合

　　[0066]使用检测设备测定化妆品中铅、砷、汞及铬的含量，结果均未检出，说明本发明中

　　[0068]采用4只雌性健康成年的普通级新西兰白色家兔，试验前24h，将实验动物背部脊

　　柱两侧毛剪掉，去毛范围左、右各约3cm×3cm，确认动物皮肤完好无损后进行试验；取精华

　　液0.5mL涂在左侧去毛皮肤上，然后用二层纱布(2.5cm×2.5cm)和一层玻璃纸覆盖，再用无

　　刺激性胶布和绷带加以固定，右侧皮肤涂抹0.5mL纯化水作为阴性对照。采用封闭试验，敷

　　用时间为4h，试验结束后用温水清除残留的精华液；于清除精华液后1、24、48和72h观察受

　　试部位皮肤反应和皮肤刺激强度。结果：24、48和72h试验组和对照组各观察时点对家兔的

　　[0070]选择面积不超过50mm2，深度为1mm的合适斑试器，以封闭式斑贴试验方法，将精华

　　液约0.020‑0.025mL(g)加于斑试器内，将斑试器贴敷于30名受试者(女性，年龄21‑59岁)前

　　臂曲侧，24h后去除精华液，分别去除后0.5、24、48h观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范

　　[0071]结果：人体皮肤斑贴实验结果显示，在移除后0.5h、24h、48h这3个观察点，30名受

　　试者皮肤均未出现红斑及水肿现象。综上说明本发明中所制备的精华液是安全的。

　　[0073]选择5名志愿者连续使用精华液12周，采用VISIA‑CR面部图像分析仪对志愿者进

　　后志愿者泛红情况的变化。实验结果表明5名志愿者的泛红情况均有不同程度的改善，表明

　　使用该精华液可以缓解皮肤炎症，具有一定的舒缓效果。图5是一名志愿者使用精华液后脸

　　部泛红变化图，与使用前相比，使用精华液12周后，脸部泛红情况有明显改善。

　　[0074]本发明制备的干细胞衍生物精华液中，人脐带间充质干细胞衍生物上清液占比

　　高，且该人脐带间充质干细胞衍生物上清液中含有多种人体细胞因子，可以直接渗入肌肤，

　　作用于组织细胞，促进皮肤干细胞修复和再生，强化皮肤屏障，从根源上改善皮肤老化，具

　　有抗炎与再生效果，经重金属和微生物检验、人体斑贴试验、毒理实验检测及功效测试证明

　　[0075]以上所述，仅是本发明的优选实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任

　　何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等

　　效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所

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