人骨髓间充质干细胞对人精原干细胞体外增殖的影响.pfg.pdf.pdf

　　英文缩写单词英文缩写英文全称 SSCs 中文名称 Spermatogonial Stem Cells 精原干细胞 BMSCs Bone marrow mesenchymal stem骨髓基质细胞 STO LIF cells SIMMouse Embryo—derived SIM小鼠胚胎成纤维细胞 and Ouabain resistant硫代鸟嘌呤和乌本苷亚系 Leukaemia Inhibitory Factor 白血病抑制因子 SCF Stem Cell Factor 干细胞生长因子 FCS FetalCalfSerum PBS Tris 胎牛血清 Phosphate-buffered Solution 磷酸盐缓冲溶液 Trihydroxymethyl Aminomethane 三羟基氨基甲烷缓冲液 rpm Revolutions PerMinute 每分钟转速泸州医学院硕士研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。学位论文中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名:豸中许角签字目期:艚r月四日泸州医学院学位论文版权使用授权书本人完全了解泸州医学院有关保留、使用学位论文的规定, 即:泸州医学院有权保留并向口有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权泸州医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其它复制手段保存学位论文,即:泸州医学院具有学位论文的数字化制品复制权,信息网络传播权和汇编权。保密的学位论文在解密后适用本授权书。南宫28官方网站学位论文作者签名:御片咱签字日期:声昭年F月功日导师签名签字日期人骨髓间充质干细胞对人精原干细胞体外增殖的影响摘要目的:探讨人骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离及纯化的方法;人精原干细胞(Spermatogonial stemcells,SSCs)在人骨髓间充质干细胞饲养层上的生物学特征及增) 殖的可能机制。方法:①人骨髓间充质干细胞的培养及鉴定:流产 4h胎儿取双侧股骨,去除贴附在骨表面的肌肉组织,剪断两端骨垢, 用DMEM培养基冲洗骨髓腔细胞入离心管,吹打后离心8min(速度 1000ffs),去上清,加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,调整细胞浓度为6x105/mL接种,将细胞置于37。C恒温、5%C02的孵箱内培养4h后,换液去除未贴壁细胞,以后每3d换液。当细胞铺满培养瓶底70%.80%时传代,传代前24h细胞换液;吸出废液,PBS冲洗, 加含有EDTA的胰酶消化2min,Hank’S终止消化,吹打,离心,按 1:2的比例传代,将细胞置37。C孵箱培养,4h换液,进一步纯化 BMSC,以后每3d换液。倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特征,应用MTT法间接测定各代骨髓间充质干细胞活性。检测骨髓间充质干细胞表面标志物CD44。②人支持细胞培养及鉴定: 无菌条件下剪开睾丸囊取出睾丸置培养皿中,去白膜后移至试管内尽可能剪碎,加入十倍体积的lmg/mL胶原酶Ⅳ,在37。C、5%C02条件下作用20min,静止后去上清,%胰酶消化4min,加含血清 DMEM终止消化,吹打,静止后取上清,离心8min(速度1000ffs), 去上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基调节细胞密度至 3x105个/mL接种在培养瓶内,将细胞置于37。C恒温、5%C02的孵箱内培养4h,换液去除未贴壁细胞。南宫28官方网站当细胞铺满培养瓶底70%-80%时传代,传代前24h细胞换液。吸除废液,PBS冲洗,加含有EDTA的胰酶消化2min,加Hank’S终止消化,吹打使细胞重悬,离心,按l:2 的比例传代,将细胞置37℃孵箱培养,以后每3d换液。鉴定:支持细胞的油红O染色,用以鉴定支持细胞。③饲养层的制备:当培养的人骨髓间充质干细胞铺满培养瓶底70%.80%时,用含10 ug/, PBS液清洗后随机取一组作为饲养层备用,另一组作为对照组(CG)。当培养的人支持细胞铺满培养瓶底70%一80%时,用丝裂霉素C处理, 方法同上,作为饲养层备用。④精原干细胞的纯化及鉴定:取材方法同培养支持细胞。将睾丸细胞悬液置于37。C恒温、5%C02的孵箱内培养,4h后吸取培养液,8min(速度1000r/s)离心后,去上清加含10% 胎牛血清的DMEM培养基,吹打,取少许细胞滴片

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