摘要,精原干细胞(SSCs)能够自我更新,产生大量分化的生殖细胞并在出生以后形成精子,将遗传信息传递给下一代。因为所有雌性生殖干细胞在出生前已停止增殖,所以SSCs是成年哺乳动物唯一的生殖干细胞。将有生育能力的雄性供体睾丸细胞移植到不育症雄性睾丸细胞中,不育症的雄性可以重新进行精子发生和恢复生育能力。这项移植技术已经用来研究SSCs的生物学特性。研究发现,精原干细胞可以在小鼠的曲细精管进行复制,然后迁移,精原干细胞所需自我更新的生长因子保存在哺乳动物中。因此相信该培养技术很快会被应用于人类的精原干细胞中。本文讨论了现有的和潜在的运用移植技术和体外培养精原干细胞的方法。由于辅助的生殖技术能使精子细胞进入卵母细胞使之受精,所以在体外培养分化精原干细胞使之成为成熟生殖细胞的技术,将会促使人的临床精原干细胞的应用得到长足发展。
生殖细胞负责将个体的遗传信息传到下一代,并通过这个过程保证该物种的连续性。最近研究发现,雄性老鼠的精原干细胞(SSCs)具有自我更新、复制和迁移的能力。干细胞的这个潜力将成为在临床上治疗不孕不育和再生医学的新时代核心[1~3]。
应用在人类医学的例子是将精原干细胞移植到不育雄性的生精小管中,恢复其生育能力。众多分子遗传学研究发现,内分泌疾病和代谢性疾病存在生殖系基因突变[4],这些突变往往导致机体代谢失常,甚至威胁到生命。为防止那些致命或危及生命的疾病引起的先天缺陷,使用精原干细胞的生殖基因治疗法将会成为一条有前途、有可行性的途径。生殖基因治疗法适用于许多遗传性疾病,如囊性纤维化、血友病、镰状细胞贫血等[5]。南宫28官方网站为了运用这种新的治疗方法,体外培养人类精原干细胞是
基金项目,本课题由现代农业产业技术体系岗位,CARS-37-04B,和农业部948计划重点项目,2011-G26,资助完成。作者简介,种振路,男,硕士研究生。
一个先决条件,在体外用诱导分化技术使精原干细胞成为功能性雄性生殖细胞的技术进展将是非常有价值的。
精原干细胞形成后即不断更新和产生精原细胞,精原细胞分化成精子,是由基因表达和环境因素所决定的。为平衡自我更新和SSCs的分化,必须严格监管以维持正常的精子,然而决定自我更新或分化的机制并不明确。一些证据表明激素具有调节精子发生的功能[6]。虽然大多数研究集中在精原干细胞后期的精子发生和睾丸体细胞,包括支持细胞、间质细胞、肌样细胞,但激素因素可能通过睾丸体细胞在精原干细胞的自我更新中起到一定的作用。在睾丸中只有SSCs能够进行自我更新,因此,它们负责维持整个雄性生活精子的发生。由于出生后的雌性生殖细胞不具备自我更新的能力,因而在正常情况下,SSCs是成年哺乳动物体内唯一的干细胞,能够增殖和将遗传信息传递给下一代[7,8]。
(ES)具有多能性且能进行自我更新。胚胎干细胞系能够通过小鼠、人类或猴子的囊胚培养建立,并认为起源于囊胚的胚胎内细胞团在体外分化。胚胎干细胞有类似外胚层细胞的发育潜力[9]。此外,通过培养小鼠或人的胎儿性腺能够得到胚胎干细胞的多能干细胞,这种细胞称为胚胎生殖细胞(EG)。
胚胎干细胞或胚胎干细胞样细胞在体内不存在,但在体外存在于胚胎或胎儿的原始细胞衍生产物中。原始生殖细胞在胎儿性腺中并不能连续地进行自我更新,然而它们产生的EG在体外自我更新就和胚胎干细胞一样。ES和EG注射进入囊胚时,能够分化成生殖细胞和所有三胚层[10]。PGCs是生殖母细胞的自然前体,并产生SSCs。ES、EG和SSCs具有自我更新的能力,有助于生殖系细胞,PGCs似乎是体外EG和体内精原干细胞发育的共同前体细胞。通过上述可以得知,胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、原始生殖细胞和精原干细胞之间是密切相关的。
十几年前有报道称将睾丸细胞移植入雄性小鼠的曲细精管内得到了发育。在这个过程中,供体细胞在能生育的小鼠睾丸中获得,并表达报告基因[11]。将单细胞悬浮液显微注射到不育成年老鼠的曲细精管中,以小鼠作为材料,用三个不同的方法将供体细胞引入受体小管均得到了发育。第一种方法是用微量管将细胞直接注射入曲细精管中,通过睾丸网细胞流到其他小管,而所有的小管都连接在一起。第二种方法是用微量管将细胞直接注射入睾丸网。第三种方法是将供体细胞注射入大的输出管中,由此到睾丸网。由于所有的小管都通过睾丸网,所以进入睾丸网的细胞悬浮液可以填满整个曲细精管。以上三种方法均在小鼠体内使用过[12]。
在这三种方法中都使用了显微注射,只有一部分供体精原干细胞从曲细精管的基底膜开始移植和增殖。这个比例将会随着不同的物种而变化,估计小鼠的比例有5%~12%。在小鼠上,在移植后的第一个月,大多数增殖的供体细胞仍然在基底膜上。南宫28官方网站但是移植两个月后,分化的生殖细胞从基底膜开始向管腔填充,精子在供体细胞移植的管腔内。在雄性接受者中,重组的精子发生的集落不断产生精子。每个供体精子发生的集落是由一个
单一的精原干细胞发育而来。在接受供体的单倍体细胞后,受体小鼠变得能生育和产生后代,这显示出精子由移植的干细胞发育而来[13]。很明显,这些精子发生产生的集落细胞是精原干细胞。
干细胞具有一定的生物功能,它们不仅有自我更新的能力,而且经过分化可产生子细胞。利用移植技术的功能鉴定,能够准确地在任何供体细胞群落中检测到精原干细胞。因此,睾丸细胞移植的方法为鉴定和研究精原干细胞的基本生物活性奠定了基础。虽然许多成年组织通过组织特异性干细胞进行维持,但只有几种类型的干细胞,造血干细胞、精原干细胞、表皮干细胞,可以准确无误地通过功能检测,并完全替代依赖的组织或系统的发生[14]。精原干细胞和功能移植实验不仅对研究和修改雄性生殖系很重要,而且是形成独特的和干细胞相关的实验系统的基础。
目前,许多癌症患者通过化疗、放疗或两者兼有的方式进行治疗。虽然生还率提高了,但在癌症治疗后,患者的生育能力能否恢复对生活质量有很重要的意义。自从第一次报道老鼠精原细胞成功移植和成功冷冻贮藏精原干细胞以来,冷冻患者自身精原干细胞的移植被认为是一种可行的恢复化疗或放疗后患者不育的技术[15]。虽然男性的冷冻精液可以进行人工授精或体外受精,但这种方法的成功率并不高[16],此外这种方法对青春期前的患者并不适用。对青春期前的患者或成年雄性,精原干细胞冷冻保存和移植提供了一个恢复癌症患者恢复生育能力的选择。此外, 当人类精原干细胞能在体外进行增殖培养,这一定会大大提高在冷冻保存或移植前的精原干细胞的数量,能最大限度地注入SSCs到受体睾丸中。
两个进展将有助于临床使用SSCs疗法,将培养和分化的人类SSCs注到精细胞中,可用于胞浆内单精子注射来受精卵母细胞。第二个目标的实现是在SSCs成功培养的基础之上, 因为在体外成功的分化,需要连续的干细胞在体外增殖来实现分化,和提供干细胞分化为临床所用[10]。虽然在未来几年,人类SSCs的培养将能够实现,但在体外诱导分化的时间很难预见。最近通过小鼠ES产生的胚胎组织中,分离出成熟单倍体雄性干
细胞。将这些生殖细胞中最成熟的细胞核注入卵母细胞中,囊胚形成,但没有胎儿形成的报道[1 1 ]。这种方法可能允许人的一代单倍体生殖细胞成熟,但是使用人类胚胎干细胞的伦理问题依然存在,并且,单倍体生殖细胞来源于胚胎干细胞,这不能形成人类机体,除非采用细胞核移植技术。
有很多家族遗传疾病导致人类疾病。尽管存在相当大的伦理问题,在使用体外操作SSCs和移植后,生殖细胞基因治疗将是一个具有潜力的临床应用。一个携带基因突变的雄性和他们的雌性伴侣,是否选择通过生殖细胞基因治疗来纠正基因突变是一个艰难的决定。虽然在很多哺乳动物中, SSCs的自我更新信号是很保守的,但长期的老鼠试验证明,培养小鼠和大鼠的SSCs 是可能的, 因此相信人类SSCs培养将很快成为可能。一旦人类SSCs在体外进行增殖,所有已经提出的微妙基因修饰在小鼠胚胎干细胞或人体干细胞中将立即适用[6]。但是,注射有纠正基因的精原干细胞到睾丸中后, 因内源性不正确的SSCs仍然存在,纠正基因和内源性SSCs产生精子的竞争将在受精的时候产生。 因此,纠正SSCs 的体外分化的发展将是至关重要的一步。
在过去的十年里,我们对雄性生殖干细胞生物学的了解已经取得了很大的进步。这个认识以及移植和培养方法的发展,对治疗雄性不育和生殖基因治疗上有很大希望。下一个关键的问题是人类精原干细胞的培养和体外分化,前者将在未来2~3年内实现,后者可能在5~10年内实现。
[5] 姜美杰,张小鹏,张长城 精原干细胞移植技术及其应用的研究进展[J] 中国计划生育学杂志(2008) 12:028
[14]孙可,郭彤,常灏哺乳动物精原干细胞的增殖分化及其移植技术的应用[J]生物技术通报(2009)9:008
[16]王毓斌,陈斌,汪铮 精原干细胞移植现状和应用前景[J] 中华男科学杂志(2008) 14(7)